溶液与试剂:

4%多聚甲醛，0.1%triton X-100, 10%羊血清，（以上溶剂都用1xPBS配制）

抗荧光淬灭封片剂。

悬浮细胞

收集细胞：1500rpm 离心5min收集细胞，用PH 7.0的PBST洗涤后将细胞稀释到5×10⁶个/ml。用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

涂片：滴加细胞悬液于画有格子的玻片上，20μl/格， 37℃温箱中干燥。

贴壁细胞

洗涤：倾出六孔板内的细胞培养液，加入PH 7.0的1XPBS，置于摇床上洗涤，反复2次，5min/次。

步骤：

1. 固定：在培养板内加入新鲜配制的4%多聚甲醛常温下固定15-30min（先用30min）。

2. 洗涤：取出培养板，放置至室温。PBS洗涤2次，5min/次。

3. 通透：加入0.1% tritonX-100（1xPBS配制），150μL/孔（覆盖细胞即可），室温作用10min。

4. 洗涤：PBS洗涤2次，5min/次。

5. 封闭：加入PBS 10倍稀释的羊血清，150μL/孔，室温放置1h。

6. 加一抗：将一抗稀释液分别加入孔板内的玻片上，150μL/孔，37℃静置1h或4℃过夜。（稀释比请参照说明书或者预试验摸索）

7. 洗涤：PBS洗涤3次，5min/次。

8. 加二抗：每孔中加入150μL 荧光素标记anti-Rabbit/Mouse IgG，室温避光放置45min。

9. 洗涤：PBS洗涤3次，5min/次。

10. 复染：：终浓度0.1ug/ml DAPI（用蒸馏水配制），150μL/孔，复染5min。

11. 洗涤：PBS洗涤3次，5min/次，用蒸馏水清洗一次。

12. 封片：滤纸稍稍吸干后，用抗淬灭剂封片，立即观察。

13. 荧光显微镜下观察，及时拍照，做好标记。

注意：在实验过程中，要添加空白、阴性对照，以便能及时发现、分析并解决问题。

 

爬片可以用如下图片制作取出