1. 电泳
1.1 蛋白处理：细胞或组织裂解液。按每张胶200ug的量上样，如一孔梳每孔10ul，两孔梳每孔100ug，10孔梳每孔10ul，15孔梳每孔6ul。若是重组蛋白，按每块胶200ng上样。
1.2 提前配制胶或者使用预制胶，装配好电泳装置，内外槽加上预冷的电泳buffer，内外槽注满（内槽用的新的缓冲液），外槽加高于玻璃板底部位置。开始电泳，电泳条件一般为100V。电泳时间根据Protein Marker的位置确定，一般12%-14% 的胶溴酚蓝跑到胶底（未跑出）停止；10%的胶15KDa的marker跑出去（保留20KDa）停止；8%的胶25KDa的marker跑出去（保留37KDa）停止；6%的胶50KDa的marker跑出去（保留75KDa）停止。一般1h-1.5h。

2. 电转
2.1 在前一天准备电转buffer，含有10%甲醇的1×电转缓冲液配好后，置于4℃预冷过夜。一个电转槽大约1L。
2.2 把滤纸和海绵浸入电转buffer中备用。裁出合适大小的PVDF膜，以一定斜角慢慢浸入100%甲醇，务必使膜全部浸湿，处理20sec。倒去甲醇，纯水换洗3次后，尽量倒尽水，将膜浸入电转buffer，注意浸没，平衡10min以上。
2.3 小心剥离出分离胶，置于电转buffer平衡10min以上。预冷后，先在合适的载体上，如合适大小的盒盖，放好胶夹，阳极面（红色）朝下，铺上一张海绵，在海绵上铺上滤纸，用玻棒推赶出气泡，洒上buffer，铺上PVDF膜，建议两手各执其一端，一边先着陆，然后慢慢放下，有助于气泡的减少，之后铺胶，亦如此。盖上滤纸，在上面加上少量buffer，推赶气泡；再分别盖上两张滤纸后。最后加上另一块海绵，合好胶夹，并按正确电极方向插到tank中。
 2.4 组装好电转仪，一般电转条件为300mA，1hr。在甲醇中过一遍，而后纯水冲洗干净。尽量去除膜上水分，用丽春红染色3-5min， 用去纯水冲洗干净。尽量去除膜上水分，在甲醇中过一遍，常温下干燥10min以上。清洗玻璃板。

3. 抗体孵育
3.1  在膜的边角处标记样品名及分子量，用甲醇浸泡处理15秒后，纯水冲洗干净。然后用5%的脱脂奶粉（用1×TBST稀释）室温封闭1小时或4℃冰箱过夜。
3.2  一抗，用5% 脱脂奶粉/TBST或1% BSA/TBST稀释，具体稀释比例见说明书推荐稀释比。（也可以预试验摸索稀释比）
3.3   1×TBST淋洗膜3遍后，放摇床上漂洗10min。
3.4  二抗孵育及洗涤。二抗室温孵育1小时（Abways，1：40000稀释于5%脱脂奶粉/TBST），二抗浓度可根据试验调整。
3.5   PVDF膜用1×TBST淋洗3遍，再放摇床上漂洗3遍，每遍10min。
3.6   加底物及曝光。将膜放在小塑料板上，每张膜用2ml ECL底物reagent1:reagent2（V/V）= 1:1（半张膜用1ml），室温覆盖孵育5min（底物存放于4℃冰箱，须提前半小时放在室温预热），倒掉底物，塑料板边沿靠在滤纸上，吸干余液。
3.7 化学发光仪中自动曝光（需要调整曝光时间）。在化学发光仪上合并Marker和条带，之后在电脑上处理。在图片上注明详细信息如裂解液种类，抗原分子量，各泳道的稀释度，阳性对照，曝光时间，检测日期等。

附表 胶浓度

 

附表 转膜时间  

附表 试剂保存时间

10×电泳缓冲液：0.25M Tris，1.92MGlycine，1%SDS。

10×电转缓冲液：0.25M Tris，1.92MGlycine。

附表 分离胶封层所需无水乙醇的量