1、在PVDF膜的边角处标记货号及样本，用甲醇浸泡处理15秒后，纯水冲洗干净。然后用5%的脱脂奶粉（用1×TBST稀释）室温封闭1小时。

2、一抗：总抗用5% 脱脂奶粉/TBST（磷酸化用3% BSA/TBST）稀释，具体稀释比例参考说明书，孵育时间4℃过夜。

3、1×TBST淋洗膜3遍（放摇床上漂洗10min）。

4、二抗孵育及洗涤。二抗室温孵育1小时（abways，1：40000 稀释于5% MILK∕TBST），二抗浓度可根据批次间差异调整。

5、1×TBST淋洗膜3遍（放摇床上漂洗10min）。

6、加底物及曝光。将膜放在小塑料板上，每张膜用2ml ECL底物reagent1:reagent2（V/V）= 1:1（半张膜用1ml），室温覆盖孵育2-5min（底物存放于4℃冰箱，须提前半小时放在室温预热），倒掉底物，塑料板边沿靠在滤纸上，吸干余液，将塑料板夹在透明塑料膜中。化学发光仪中自动曝光。